离子交换（IEX）层析能够分离电荷只有轻微差别的一分子或组分子。以保证分离是基于带电分子与带相反电荷的层析填料之间的可逆相互作用。通常情况

下，选择条件被感兴趣的分子随着上样柱上而结合到层析填料然后改变条件以便使被结合的物质被洗脱。经常通过连续梯度或逐步增加离子强度进行洗脱，常使用NaCl。

蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的pH，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都有其针对pH的静电荷关系，这可以被视为滴定曲线（。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。

离子交换剂的选择

以强交换剂(Q, S, SP)开始，能够在广泛的pH范围进行开发工作。如果感兴趣蛋白的等电点低于pH 7.0或未知，则使用强阴交换剂（Q）结合蛋白。当在一个pH下出现大分辨率，而且感兴趣的蛋白质在此pH下稳定时，使用强交换剂。如果强的离子交换剂的选择性不理想，则考虑使用弱的交换剂(DEAE, ANX, CM)，但请记住弱的离子交换剂的离子交换能力随着pH而变化。多峰配体(MMC, adhere)提供离子相互作用、氢键和疏水相互作用。MMC表现的如同弱的阳离子交换剂，但可以在高电导率下结合。Adhere表现为强阴离子交换剂。

层析柱填料选择

根据纯化步骤的目标和起始材料的条件选择离子交换填料。其他因素例如样品稳定性、规模、速度、结合能力和提供的设备也可能影响后的选择。

一般信息选择性和缓冲液pH

三种假定蛋白在不同pH下的分离如下所述，

酸性强pH：所有三种蛋白都处于它们的等电点，带正电荷，且只结合阳离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱下来。

较小酸性pH：蓝色的蛋白在其等电点以上，带负电荷，而其他蛋白仍然带正电荷。蓝色蛋白结合阴离子交换剂，并可以与直接洗涤穿透的其他蛋白分离。另外，红色和绿色蛋白可以在阳离子交换剂上被分离，而蓝色蛋白洗涤穿透。

碱性强pH：所有三种蛋白都高于它们的等电点，带负电荷，且只结合阴离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱。

较小碱性pH：红色蛋白低于其等电点，带正电荷。红色蛋白结合阳离子交换剂，而其他蛋白洗涤穿透。

另外，蓝色和绿色蛋白可以在阴离子交换剂上进行分离，而红色蛋白洗涤穿透。